Productos
Kit de detección RT-PCR del SARS-Cov-2 de Lifecosm para 2019-nCoV
Uso esperado
Este kit se utiliza para la detección cualitativa del nuevo coronavirus (2019-nCoV) mediante hisopos de garganta, hisopos nasofaríngeos, líquido de lavado broncoalveolar y esputo. El resultado de detección de este producto es solo para referencia clínica y no debe utilizarse como la única evidencia para el diagnóstico y tratamiento clínico. Se recomienda un análisis completo de la condición en combinación con las manifestaciones clínicas del paciente y otras pruebas de laboratorio.
Principio de inspección
El kit se basa en la tecnología RT-PCR de un solo paso. De hecho, se seleccionaron los genes ORF1ab y N del nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV) como regiones diana de amplificación. Se diseñaron cebadores y sondas fluorescentes específicos (las sondas del gen N están marcadas con FAM y las sondas ORF1ab con HEX) para detectar el ARN del nuevo tipo de coronavirus 2019 en las muestras. El kit también incluye un sistema de detección de control interno endógeno (sonda del gen de control interno marcada con CY5) para monitorizar el proceso de recolección de muestras, la amplificación del ARN y la PCR, reduciendo así los falsos negativos.
Componentes principales
| Componentes | Volumen（48T/Kit） |
| Solución de reacción de RT-PCR | 96 µl |
| Cebador nCOV Mezcla de sonda TaqMan (ORF1ab, gen N, gen RnaseP) | 864 µl |
| Control negativo | 1500 µl |
| nCOV Control positivo (gen ORF1ab N) | 1500 µl |
Reactivos propios: Reactivos de extracción o purificación de ARN. Control negativo/positivo: El control positivo es ARN que contiene el fragmento diana, mientras que el control negativo es agua sin ácidos nucleicos. Durante su uso, deben participar en la extracción y deben considerarse infecciosos. Deben manipularse y eliminarse de acuerdo con la normativa vigente.
El gen de referencia interno es el gen RnaseP humano.
Condiciones de almacenamiento y fecha de caducidad
-20 ± 5 ℃, evitar la congelación y descongelación repetidas más de 5 veces, válido por 6 meses.
Instrumento aplicable
Con FAM/HEX/CY5 y otros instrumentos de PCR fluorescentes multicanal.
Requisitos de la muestra
1. Tipos de muestras aplicables: hisopos de garganta, hisopos nasofaríngeos, líquido de lavado broncoalveolar, esputo.
2. Recogida de muestras (técnica aséptica)
Hisopado faríngeo: Limpie las amígdalas y la pared faríngea posterior con dos hisopos al mismo tiempo, luego sumerja la cabeza del hisopo en un tubo de ensayo que contenga la solución de muestreo.
Esputo: Después de que el paciente presente una tos profunda, recoja el esputo tosido en un tubo de ensayo con tapa de rosca que contenga la solución de muestreo; líquido de lavado broncoalveolar: Muestreo por profesionales médicos. 3. Almacenamiento y transporte de muestras
Las muestras para el aislamiento del virus y las pruebas de ARN deben analizarse lo antes posible. Las muestras que se detecten en 24 horas pueden almacenarse a 4 °C; las que no se detecten en 24 horas...
Las horas deben almacenarse a -70 ℃ o menos (si no hay una condición de almacenamiento de -70 ℃, deben almacenarse
Las muestras deben almacenarse temporalmente en un refrigerador a -20 °C. Evite la congelación y descongelación repetidas durante el transporte. Las muestras deben enviarse al laboratorio lo antes posible después de su recolección. Si las muestras deben transportarse largas distancias, se recomienda almacenarlas en hielo seco.
Métodos de prueba
1 Procesamiento de muestras y extracción de ARN (área de procesamiento de muestras)
Se recomienda tomar 200 μl de muestra líquida para la extracción de ARN. Para conocer los pasos de extracción, consulte las instrucciones de los kits comerciales de extracción de ARN. Tanto el negativo como el negativo
Los controles de este kit estuvieron involucrados en la extracción.
2 Preparación de reactivos de PCR (área de preparación de reactivos)
2.1 Retire todos los componentes del kit, descongélelos y mézclelos a temperatura ambiente. Centrifugue a 8000 rpm durante unos segundos antes de usar; calcule la cantidad necesaria de reactivos y prepare el sistema de reacción como se muestra en la siguiente tabla:
| Componentes | Porción N (sistema de 25 µl) |
| Cebador nCOV mezcla de sonda TaqMan | 18 µl × N |
| Solución de reacción de RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = número de muestras analizadas + 1 (control negativo) + 1 (nCOV)control positivo) | |
2.2 Después de mezclar bien los componentes, centrifugue durante un breve período para dejar que todo el líquido de la pared del tubo caiga al fondo del tubo y luego alicuote 20 µl del sistema de amplificación en el tubo de PCR.
3 Muestreo (área de preparación de muestras)
Añadir 5 μl de los controles negativo y positivo tras la extracción. El ARN de la muestra a analizar se añade al tubo de reacción de PCR.
Tape bien el tubo y centrifugue a 8.000 rpm durante unos segundos antes de transferirlo al área de detección de amplificación.
4 Amplificación por PCR (área de detección amplificada)
4.1 Coloque el tubo de reacción en la celda de muestra del instrumento y configure los parámetros de la siguiente manera:
| escenario | Ciclo número | Temperatura(°C) | Tiempo | recopilaciónsitio |
| Contrarrestartranscripción | 1 | 42 | 10 minutos | - |
| Pre-desnaturalizaciónn | 1 | 95 | 1 minuto | - |
| Ciclo | 45 | 95 | 15 segundos | - |
| 60 | años 30 | recopilación de datos |
Selección del canal de detección del instrumento: Seleccione los canales FAM, HEX y CY5 para la señal de fluorescencia. Para la fluorescencia de referencia NONE, no seleccione ROX.
5 Análisis de resultados (consulte las instrucciones experimentales de cada instrumento para la configuración)
Tras la reacción, guarde los resultados. Tras el análisis, ajuste el valor inicial, el valor final y el valor umbral de la línea base según la imagen (el usuario puede ajustarlo según la situación real; el valor inicial se puede establecer entre 3 y 15, el valor final entre 5 y 20). En el gráfico logarítmico, la línea del umbral se encuentra en la fase logarítmica y la curva de amplificación del control negativo es una línea recta o está por debajo de la línea del umbral.
6 Control de calidad (se incluye un control de procedimiento en la prueba) Control negativo: No hay una curva de amplificación obvia para los canales de detección FAM, HEX, CY5.
Control positivo COV: curva de amplificación obvia de los canales de detección FAM y HEX, valor Ct ≤ 32, pero no hay curva de amplificación del canal CY5;
Los requisitos anteriores deben cumplirse simultáneamente en el mismo experimento; de lo contrario, el experimento no es válido y debe repetirse.
7 Determinación de resultados.
7.1 Si no hay una curva de amplificación o un valor Ct > 40 en los canales FAM y HEX de la muestra de prueba, y hay una curva de amplificación en el canal CY5, se puede juzgar que no hay ARN del nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV) en la muestra;
.2 Si la muestra de prueba tiene curvas de amplificación obvias en los canales FAM y HEX, y el valor Ct es ≤40, se puede juzgar que la muestra es positiva para el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV).
7.3 Si la muestra de prueba presenta una curva de amplificación clara solo en un canal de FAM o HEX, y el valor de Ct es ≤40, y no hay curva de amplificación en el otro canal, es necesario volver a analizar los resultados. Si los resultados de la nueva prueba son consistentes, la muestra puede considerarse positiva para el nuevo ensayo.
Coronavirus 2019 (2019-nCoV). Si el resultado de la nueva prueba es negativo, se puede determinar que la muestra es negativa para el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV).
Valor de juicio positivo
El método de la curva ROC se utiliza para determinar el valor de CT de referencia del kit y el valor de referencia del control interno es 40.
Interpretación de los resultados de las pruebas
Cada experimento debe analizarse para detectar controles negativos y positivos. Los resultados de las pruebas solo se pueden determinar cuando los controles cumplen con los requisitos de control de calidad.
2. Cuando los canales de detección FAM y HEX son positivos, el resultado del canal CY5 (canal de control interno) puede ser negativo debido a la competencia del sistema.
3. Si el resultado del control interno es negativo, y los canales de detección FAM y HEX del tubo de ensayo también son negativos, significa que el sistema está deshabilitado o que la operación es incorrecta, la prueba no es válida. Por lo tanto, es necesario volver a analizar las muestras.
