Productos
Kit de detección Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR para 2019-nCoV
Uso esperado
Este kit se utiliza para la detección cualitativa del nuevo coronavirus (2019-nCoV) mediante hisopos de garganta, hisopos nasofaríngeos, líquido de lavado broncoalveolar y esputo. El resultado de la detección de este producto es solo para referencia clínica y no debe usarse como único evidencia para el diagnóstico y tratamiento clínico. Se recomienda un análisis integral de la afección en combinación con las manifestaciones clínicas del paciente y otras pruebas de laboratorio.
Principio de inspección
El kit se basa en la tecnología RT-PCR de un solo paso.De hecho, se seleccionaron los genes ORF1ab y N del nuevo coronavirus de 2019 (2019-nCoV) como regiones objetivo de amplificación.Los cebadores específicos y las sondas fluorescentes (las sondas del gen N están marcadas con FAM y las sondas ORF1ab están marcadas con HEX) están diseñadas para detectar el ARN del nuevo tipo de coronavirus 2019 en muestras.El kit también incluye un sistema de detección de control interno endógeno (sonda genética de control interno marcada con CY5) para monitorear el proceso de recolección de muestras, amplificación de ARN y PCR, reduciendo así los resultados falsos negativos.
Componentes principales
| Componentes | Volumen(48T/juego） |
| Solución de reacción RT-PCR | 96 µl |
| Cebador nCOV Mezcla de sonda TaqMan (ORF1ab, gen N, gen RnaseP) | 864 µl |
| Control negativo | 1500 µl |
| nCOV Control positivo (gen ORF1ab N) | 1500 µl |
Reactivos propios: Reactivos de extracción o purificación de ARN.Control negativo/positivo: el control positivo es ARN que contiene el fragmento objetivo, mientras que el control negativo es agua libre de ácido nucleico.Durante su uso, deben participar en la extracción y deben considerarse infecciosos.Deben manipularse y eliminarse de acuerdo con las normas pertinentes.
El gen de referencia interno es el gen RnaseP humano.
Condiciones de almacenamiento y fecha de caducidad.
-20 ± 5 ℃, evite congelar y descongelar repetidamente más de 5 veces, válido por 6 meses.
Instrumento aplicable
Con FAM/HEX/CY5 y otro instrumento de PCR fluorescente multicanal.
Requisitos de la muestra
1.Tipos de muestras aplicables: hisopos de garganta, hisopos nasofaríngeos, líquido de lavado broncoalveolar, esputo.
2.Recolección de muestras (técnica aséptica）
Hisopo faríngeo: limpie las amígdalas y la pared faríngea posterior con dos hisopos al mismo tiempo, luego sumerja el cabezal del hisopo en un tubo de ensayo que contiene la solución de muestra.
Esputo: después de que el paciente tenga una tos profunda, recoja el esputo tosido en un tubo de ensayo con tapón de rosca que contenga la solución de muestra;Líquido de lavado broncoalveolar: muestreo por parte de profesionales médicos.3.Almacenamiento y transporte de muestras.
Las muestras para el aislamiento del virus y las pruebas de ARN deben analizarse lo antes posible.Las muestras que se pueden detectar en 24 horas se pueden almacenar a 4 ℃;aquellos que no pueden ser detectados dentro de 24
horas deben almacenarse a -70 ℃ o menos (si no hay condiciones de almacenamiento de -70 ℃, deben almacenarse
almacenado temporalmente a -20 ℃ refrigerador).Las muestras deben evitar congelarse y descongelarse repetidamente durante el transporte.Las muestras deben enviarse al laboratorio lo antes posible después de su recolección.Si es necesario transportar muestras a largas distancias, se recomienda el almacenamiento en hielo seco.
Métodos de prueba
1 Procesamiento de muestras y extracción de ARN (área de procesamiento de muestras)
Se recomienda tomar 200μl de muestra líquida para la extracción de ARN.Para conocer los pasos de extracción relacionados, consulte las instrucciones de los kits de extracción de ARN comerciales.Tanto lo negativo como lo negativo
Los controles de este kit participaron en la extracción.
2 Preparación de reactivos de PCR (área de preparación de reactivos)
2.1 Retire todos los componentes del kit, descongélelos y mezcle a temperatura ambiente.Centrifugar a 8000 rpm durante unos segundos antes de usar;Calcule la cantidad requerida de reactivos y el sistema de reacción se preparará como se muestra en la siguiente tabla:
| Componentes | porción de N (sistema de 25 µl) |
| Cebador nCOV mezcla de sonda TaqMan | 18 µl × N |
| Solución de reacción RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = número de muestras analizadas + 1 (control negativo) + 1 (nCOVcontrol positivo) | |
2.2 Después de mezclar bien los componentes, centrifugue durante un breve período para dejar que todo el líquido de la pared del tubo caiga al fondo del tubo y luego coloque en partes alícuotas el sistema de amplificación de 20 µl en el tubo de PCR.
3 Muestreo (área de preparación de muestras)
Agregue 5 μl de los controles negativo y positivo después de la extracción.El ARN de la muestra a analizar se añade al tubo de reacción de PCR.
Tape bien el tubo y centrifugue a 8000 rpm durante unos segundos antes de transferirlo al área de detección de amplificación.
4 amplificación por PCR (área de detección amplificada)
4.1 Coloque el tubo de reacción en la celda de muestra del instrumento y configure los parámetros de la siguiente manera:
| escenario | Ciclo número | Temperatura(ºC) | Tiempo | recopilaciónsitio |
| Contrarrestartranscripción | 1 | 42 | 10 minutos | - |
| Pre-desnaturalizaciónn | 1 | 95 | 1 minuto | - |
| Ciclo | 45 | 95 | 15 | - |
| 60 | 30 años | recopilación de datos |
Selección del canal de detección del instrumento: seleccione el canal FAM、HEX、CY5 para la señal de fluorescencia.Como referencia fluorescente NINGUNO, no elija ROX.
5 Análisis de resultados (consulte las instrucciones experimentales de cada instrumento para configurarlo)
Después de la reacción, guarde los resultados.Después del análisis, ajuste el valor inicial, el valor final y el valor umbral de la línea de base de acuerdo con la imagen (el usuario puede ajustar de acuerdo con la situación real, el valor inicial se puede configurar en 3 ~ 15, el valor final se puede configurar en 5~20, ajuste) en el gráfico logarítmico. En el umbral de la ventana, la línea de umbral está en la fase logarítmica y la curva de amplificación del control negativo es una línea recta o por debajo de la línea de umbral).
6 Control de calidad (se incluye un control de procedimiento en la prueba) Control negativo: No hay curva de amplificación obvia para los canales de detección FAM, HEX, CY5
Control positivo COV: curva de amplificación obvia de los canales de detección FAM y HEX, valor Ct≤32, pero sin curva de amplificación del canal CY5;
Los requisitos anteriores deben cumplirse simultáneamente en un mismo experimento;de lo contrario, el experimento no será válido y deberá repetirse.
7 Determinación de resultados.
7.1 Si no hay curva de amplificación o valor Ct > 40 en los canales FAM y HEX de la muestra de prueba, y hay una curva de amplificación en el canal CY5, se puede juzgar que no hay nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV) ARN en la muestra;
.2 Si la muestra de prueba tiene curvas de amplificación obvias en los canales FAM y HEX, y el valor de Ct es ≤40, se puede juzgar que la muestra es positiva para el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV).
7.3 Si la muestra de prueba tiene una curva de amplificación clara solo en un canal de FAM o HEX, y el valor de Ct es ≤40 y no hay una curva de amplificación en el otro canal, es necesario volver a analizar los resultados.Si los resultados de la nueva prueba son consistentes, se puede considerar que la muestra es positiva para el nuevo
coronavirus 2019 (2019-nCoV).Si el resultado de la nueva prueba es negativo, se puede juzgar que la muestra es negativa para el nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV).
Valor de juicio positivo
El método de la curva ROC se utiliza para determinar el valor CT de referencia del kit y el valor de referencia del control interno es 40.
Interpretación de los resultados de las pruebas.
1. Cada experimento debe analizarse en busca de controles positivos y negativos.Los resultados de las pruebas sólo pueden determinarse cuando los controles cumplen con los requisitos de control de calidad.
2.Cuando los canales de detección FAM y HEX son positivos, el resultado del canal CY5 (canal de control interno) puede ser negativo debido a la competencia del sistema.
3. Cuando el resultado del control interno es negativo, si los canales de detección FAM y HEX del tubo de ensayo también son negativos, significa que el sistema está deshabilitado o la operación es incorrecta, la prueba no es válida.Por lo tanto, es necesario volver a analizar las muestras.
